細胞轉染之PEI轉染法

實驗專欄---PEI 細胞轉染

      陽離子聚合物 - 聚乙烯亞胺（PEI）是目前報道的工業化、大規模瞬時轉染表達重組蛋白領域使用的基因載體和轉染試劑。人胚胎腎細胞（HEK293）和中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞是目前工業大規模瞬時轉染領域使用的宿主細胞。PEI 是基因載體中的陽離子聚合物之 一，因為其具有高的轉染效率，所以作為基因轉染的黃金標準而常被用來參照。 PEI 形成復合物的分子量通常在 5 ～ 25 kDa之間。高分子量 PEI 一般比低分子量 PEI 有 更高轉染效率，但問題在于，高分子量的 PEI 往往有 較高的細胞毒性， 這一規律與其他聚陽離子類似。目前主要有三種主流方法：生物轉染，物理轉染和化學轉染。化學轉染方法是生物醫學研究中轉染方法，主要包括兩類：陽離子脂質體和陽離子聚合物。其基本原理是利用陽離子的化學分子與帶有負電荷的核酸通過正負電荷作用形成穩定的復合物。

PEI轉染機制

目前使用的陽離子聚合物轉染試劑是 PEI。PEI 制備簡單，價格便宜，有線狀和枝狀兩種商業試劑可選，是瞬時轉染放大轉染試劑的*，是非常有潛力的非病毒質粒載體試劑。
由于PEI 帶正電荷，與帶負電荷的DNA 結合形成帶正電荷的 PEI-DNA 復合物，可以與帶負電荷的細胞表面結合。PEI-DNA 復合物通過胞吞作用進入細胞內部形成內涵體，之后一部分從內涵體中逃逸進入細胞核內，未逃逸的進入溶酶體被降解，無法入核的 DNA 會在 100 min 內被胞漿中的 DNA 酶降解。

PEI轉染過程

1. 細胞培養

２９３Ｔ 細胞培養于 ＤＭＥＭ［含 １０％胎牛血清（ＦＢＳ）中］，置于 ３７ ℃、５％ＣＯ２ 條件下連續培養，轉染前24ｈ 將細胞接種于６孔板中，每孔 ５×１０５ 個細胞且均勻分布，用于轉染.

2.２９３Ｔ 細胞轉染

取 ６ 孔板細胞，ＰＢＳ 緩沖液洗滌兩次，轉染組細胞分別加入脂質體轉染混合和 ＰＥＩ 轉染混合液，對照組加 入 等 量 無 血 清 ＤＭＥＭ，邊 加 邊 混 勻，３７ ℃，５％ＣＯ２ 培養 ６ ｈ。轉染后去除轉染混合液，每孔加入*培養基２ ｍＬ 繼續培養，４８ ｈ 后檢測轉染效果。

3. 細胞活性檢測

采用 ＣＣＫ-８ 試劑盒進行檢測

4. 轉染后綠色熒光觀察及監測表達

在熒光顯微鏡下觀察轉染48ｈ后帶有綠色熒光的細胞比例，有綠色熒光說明轉染成功。

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