ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒產(chǎn)品詳解 產(chǎn)品簡(jiǎn)介

ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒產(chǎn)品詳解

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒是ProteanFect系列中專(zhuān)為難轉(zhuǎn)細(xì)胞系基因編輯而設(shè)計(jì)的創(chuàng)新產(chǎn)品。該試劑盒基于自組裝蛋白納米顆粒技術(shù)，作為一種非病毒、非電轉(zhuǎn)、非脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染試劑，能夠高效且安全地將基因編輯工具RNP（包含Cas9蛋白和guide RNA）遞送至細(xì)胞內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)高效的基因編輯。

儲(chǔ)存與成分

運(yùn)輸與儲(chǔ)存?：ProteanFect CRISPR Ultra 轉(zhuǎn)染試劑盒采用干冰運(yùn)輸，收到后應(yīng)立即存放于-80℃直至使用。

試劑盒規(guī)格?：依據(jù)Reagent B的體積設(shè)定。

試劑盒組分及存儲(chǔ)?：

Reagent A（PT07）：使用后保存于2-8℃。

Reagent B（PT07）：保存于-20℃，避免反復(fù)凍融。

Cas9 protein（1 µg/µL）：保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

EGFP mRNA（1 µg/µL）：陽(yáng)性對(duì)照，保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

Human TRAC-sgRNA（1 µg/µL）：陽(yáng)性對(duì)照，靶向序列為T(mén)GTGCTAGACATGAGGTCTA，保存于-80℃，避免反復(fù)凍融。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

待轉(zhuǎn)染細(xì)胞?：細(xì)胞必須處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，活率＞90%。

推薦培養(yǎng)基?：Opti-MEM培養(yǎng)基（或無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)基/無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基），提前預(yù)熱至室溫。

轉(zhuǎn)染試劑?：室溫自然解凍，顛倒或渦旋至溶液均一后使用。

其他材料?：完·全培養(yǎng)基、無(wú)菌EP管、所需轉(zhuǎn)染的核酸樣品。

操作步驟（以96孔板體系為例）

配置ProteanFect轉(zhuǎn)染體系?：

在40 µL Reagent A（PT07）中加入0.8 µg（約5 pmol）Cas9 protein和0.3 µg（約10 pmol）sgRNA，充分混勻。

加入1.4 µL Reagent B（PT07），移液槍上下吹打20-30次或渦旋10秒，使其充分混勻。配置完成后置于冰上保存；如需在室溫下保存，須在30分鐘內(nèi)使用完畢。

細(xì)胞處理?：

懸浮細(xì)胞?：取待轉(zhuǎn)染細(xì)胞，300g離心5分鐘，棄去上清后以O(shè)pti-MEM重懸細(xì)胞沉淀，再次離心，最終用Opti-MEM重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×10? - 1×10? cells/mL備用。

貼壁細(xì)胞?：轉(zhuǎn)染前匯合率保持在50%-80%，棄去培養(yǎng)基后，用Opti-MEM輕柔清洗細(xì)胞兩次，并加入20 µL Opti-MEM備用。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染?：

將配置好的ProteanFect轉(zhuǎn)染體系與20 µL細(xì)胞懸液混合后，在離心管中孵育（或直接加入貼壁細(xì)胞中）。

37℃培養(yǎng)箱孵育45-60分鐘（孵育時(shí)間可根據(jù)不同細(xì)胞類(lèi)型進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整）。

加入約5倍轉(zhuǎn)染體系體積的完·全培養(yǎng)基，300g離心5分鐘，棄去上清（貼壁細(xì)胞可直接棄去混合液并補(bǔ)加培養(yǎng)基）。

細(xì)胞培養(yǎng)與觀察?：

加入適量完·全培養(yǎng)基，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，72小時(shí)后可對(duì)靶點(diǎn)進(jìn)行編輯效率分析。

轉(zhuǎn)染不同規(guī)格孔板的使用含量

以下提供了不同規(guī)格孔板轉(zhuǎn)染時(shí)的各組分使用含量：

孔板類(lèi)型Reagent A（PT07）Cas9 protein/sgRNAReagent B（PT07）推薦每孔細(xì)胞數(shù)（Opti-MEM）

96孔40 µL0.8 µg/0.3 µg1.4 µL1×10^5~2×10^5（20 µL）

48孔80 µL1.6 µg/0.6 µg2.8 µL2×10^5~4×10^5（40 µL）

24孔200 µL4 µg/1.5 µg7 µL4×10^5~1×10^6（100 µL）

12孔600 µL7.5 µg/4.5 µg21 µL1×10^6~3×10^6（300 µL）

6孔800 µL16 µg/6 µg28 µL2×10^6~4×10^6（400 µL）

數(shù)據(jù)分享

使用ProteanFect CRISPR Ultra轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，并使用試劑盒中的Human TRAC-sgRNA陽(yáng)性對(duì)照敲除TRAC基因。轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集細(xì)胞DNA水平檢測(cè)基因敲除效率。結(jié)果顯示，陽(yáng)性對(duì)照組中靶點(diǎn)基因被編輯的比例約為63.4%，平均編輯效率約為63.9%。

常見(jiàn)問(wèn)題解答

如何提升轉(zhuǎn)染效率?？

根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型和培養(yǎng)條件優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

適當(dāng)延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間（通常細(xì)胞系不超過(guò)2小時(shí)）。

適當(dāng)增加轉(zhuǎn)染體系至初始的1.5-2.5倍。

細(xì)胞系轉(zhuǎn)染前處理?？

使用活性超過(guò)90%的細(xì)胞。

不建議使用傳代次數(shù)超過(guò)15次的細(xì)胞。

新復(fù)蘇的細(xì)胞需傳代2-3次后使用。

關(guān)于EGFP mRNA陽(yáng)性對(duì)照的使用?？

首·次嘗試時(shí)，建議設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（EGFP mRNA），以檢測(cè)實(shí)驗(yàn)操作和試劑的有效性。使用96孔板的細(xì)胞量即可，節(jié)省細(xì)胞和試劑。

RNP的投入量如何確定?？

Cas9蛋白和sgRNA的摩爾比推薦在1：1-1：2.5之間。

以96孔細(xì)胞量的轉(zhuǎn)染體系為例，Cas9蛋白的投入量在0.8 µg-1.6 µg。

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞處理?？

轉(zhuǎn)染后，細(xì)胞狀態(tài)可能與未處理組略有差異。但使用ProteanFect試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，對(duì)細(xì)胞活力的損傷較小。通常在轉(zhuǎn)染后第二天，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)基本恢復(fù)。

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